把握细节提高猪场非洲猪瘟荧光PCR检测结果的准确性

　　随着非洲猪瘟在全国范围内发生和流行，猪场引种、人员、车辆、入场物品、猪场环境等都需要进行非洲猪瘟病毒检测，以防止疾病传入。虽有专门第三方检测实验室从事非洲猪瘟病毒核酸检测工作，但一则收费高，二则因距离远样品不能及时送达，或实验室检测样本量不能及时出具结果，各猪场均有自建实验室检测的强烈需求。国家相关允许猪场自行检测非洲猪瘟病毒政策的出台，客观上推动了非洲猪瘟病毒荧光检测因素众多，涉及实验室硬件、仪器、试剂、人员素质、技术水平、管理水平等多方面，即使是丰富经验的人员仍不免遇到各种问题，导致检结果不准确，造成一定的损失。为获得准确可靠的结果，需要从仪器选择、试剂耗材等物品准备和操作细节上做好把控，笔者就荧光非洲猪瘟病毒核酸荧光检测的各方面进行探讨，希望能对基层实验室非洲猪瘟病毒核酸检测人员提供参考。

　　PCR检测实验室选址要远离猪场，一定要做好分区，资金充足的话最好建设高标准实验室，控制气流方向。至少也要做到物理分区，样本处理区、核酸制备区、扩增区，人员、物品单向流动。每个区域固定专用移液器，带滤芯枪头，离心管、一次性手套、工作服等，严禁带出本区域。

　　严格控制人员进出，与检测无关的人员不得随意进出实验室。检测人员专人专岗，获得相应资格后方可上岗，定期培训和考核，以提升检测人员的检测技能。尽量减少在实验区内不必要的走动。在实验操作过程中，严格遵守相关规程，穿戴一次性的防护服、头套、口罩、手套和鞋套。离开实验室时脱掉，与实验废弃物统一经高压灭菌处理。

　　所选用的仪器设备会影响实验结果的准确性，不同实验室应根据自己需求选择不同价格的仪器和设备。同一些有经验的试验室交流，购买口碑好的PCR仪器，有条件的话购买国外进口大品牌PCR仪，国产也有质量不错的，一般质量好的价格较贵。太便宜的仪器，最好不要用，性能不稳定，同一样本，不同PCR检测结果CT值可能相差10以上。在其他条件都相同的条件下，仅仪器的不同造成的结果差异就非常大。核酸自动提取仪器要选择能最大可能防气溶胶污染的。离心机要用转速能达到12000转以上的。仪器设备要定期维护和保养，一旦发现异常应当及时维修，以保证仪器正常运转，确保检验结果科学准确。

　　市场上非洲猪瘟检测试剂盒品种繁多，价格和差别较大，即使经过农业部比对的公司非瘟检测产品存在多种，疫苗毒鉴别，多重检测。仅核酸扩增部分试剂价格国产试剂一般20元每份，价格最低可到几块钱，国外一般80元每份。贵的试剂可能质量好，但不会一般猪场能用的起的。要按试剂盒的要求妥善保存试剂，避免使用伪劣、过期或失效试剂。有的猪场为降低成本，根据一些OIE、国家或行业标准等权威资料公布的引物和探针，自己合成，自己购买试剂进行检测，这种做法也不是不可以，但对人员要求极高，一定要跟市场上口碑好的试剂盒充分比对，对各种反应条件进行优化，否则可能会漏检率增加，给猪场造成不必要的损失。

　　与送样人员保持沟通，提前了解要检测样本量，做好充分准备，以免试剂不足。样本采集种类，运输和保存条件，能否及时检测都影响检测结果的准确性。猪场检测中应用较多的是非洲猪瘟病毒日常监测及发病后精准清除，样本涉及组织、血液、、口鼻拭子、唾液、环境样本等多方面。样本要新鲜，及时检测，减少冻融次数。采集抗凝血时抗凝剂选用EDTA，充分混匀，不要用肝素，因肝素会抑制PCR反应。制备血清时，采血静置一段时间，不颠簸，不冷冻，防溶血。猪唾液样本采集前4小时，停水、停料，保证样品不含食物残渣，不被稀释，最好加核酸保护剂。人员、环境样本可用棉拭子或纱布采集，尽量做到环境全覆盖。饲料样本生理盐水浸泡后取上清，必要时透析袋浓缩后检测。水样为提高检出率，最好也要浓缩，对一些资料说的可用0.22微米滤器浓缩浓度的做法笔者并不认同，有待于进一步验证。所采集样本要冷链保存和运输。

　　为降低检测工作量和检测成本费用，可根据实际需要，将不同样本混样检测。混样比例不要过高，否则容易导致假阴性。混样检出阳性者，需要不同样品分开重新单独检测。检测样品要做好留样备份，做好登记，标记清晰，防止样品间交叉污染。检测疑似阳性样品，应单独保存。在样品复核和送检完成后对样品及时进行无害化处理。

　　核酸制备的质量关系到检测结果的准确性。核酸制备方式有传统煮沸裂解法、柱式法和磁珠法三种。煮沸裂解法通过几种组分快速处理样本，快速释放病毒核酸，操作速度快，能满足组织及血样本快速筛查，但制备核酸不纯，干扰物质多。实验室中不能常用，否则易形成气溶胶污染。柱式法对实验人员经验要求高，适合少量样本的高频次提取操作，人为操作影响因素多。磁珠法机器操作，自动化程度高，适合大量样本检测，但仪器试剂成本高。无论哪种方式，不同厂家试剂盒优劣不同，一定要慎重选择购买。核酸提取时动作轻柔，减少气溶胶的产生，防止样品间交叉污染。对环境样本、饲料样本、猪口鼻拭子等低病毒含量样本需要采用磁珠法或柱式提取法提取核酸，样本不要灭活，否则可能降低检测敏感性，导致漏检。核酸提取后，所有耗材及液体均要置于含消毒液的自封袋中，封口包装，避免实验室核酸气溶胶污染。核酸提取后室温防止易降解，最好直接用于扩增检测或-20℃保存。

　　柱式法核酸提取时，离心管标记清晰，以防洗涤时酒精流出，破坏样品标记，最后一步，延长离心时间，去除残留酒精，防止干扰PCR反应。在生物安全柜内加样前，紫外灯照射30分钟，物品有规律摆放，合理分区，净区在左边，污区在右边。废弃枪头打入带盖10%84消毒液中，消毒液最好先用现配，最长使用时间不要超过3天。PCR反应管选取质量好的，盖子一定密封严格，以防扩增PCR产物挥发。移液器吸头选择细长、带滤芯的以降气溶胶污染风险。PCR反应试剂化冻后，先斡旋震荡，再瞬时离心，根据自己检验需要，分装成小份，减少反复冻融次数，以防降低试剂检测效果。阳性对照每次使用前都要先斡旋震荡，再离心，管盖口朝上放置。减少各试剂在室温中时间，没必要非得像一些资料上说的在冰上操作，因一则某些实验室碎冰获取可能不方便，二则稍微不注意可能或在试剂管中带入水份，影响试剂性能。加样时操作者需戴手套，动作轻柔，防止将模板吸入加样器内或溅出离心管外，导致样本间交叉污染。加样时遵循从低浓度到高浓度的顺序，先加阴性对照，再加检测样品，最后加阳性对照。枪头用完后，盒随手关闭，吸取阳性样本和待检样本后，严禁从枪头上方经过。加样用枪头打入10% 84消毒液瓶中，盖上盖子。加样后，试剂管盖和PCR反应管盖一定要盖紧，避免多次开关盖，避免荧光物质泄漏外漏，瞬时离心混匀，避免气泡产生，致结果不准确，加上后尽快上机扩增，防止探针淬灭。不要在管盖或管体上做标记，以免影响实验结果。

　　每次试验设置阴性对照和阳性对照，必要时增加阴性对照设置数量，对不同操作节段进行监控，随机放于扩增样品中间，阳性对照不要用强阳样本，尤其不要用强阳性质粒做阳性对照，阳性对照包括提取阳性对照和扩增阳性对照，根据不同情况设置。PCR结束后PCR产物严禁开盖，以防气溶胶污染，检测过程中用到的吸头、离心管、PCR反应管及时清理，放置于10% 84消毒液瓶中，盖上盖子，在远离实验室的地方弃掉，用过的吸头等一次性材料也应经消毒液浸泡消毒后统一处理，严禁高压，因高压并不能破坏核酸，反而有潜在实验室核酸气溶胶污染的风险。样品处理过程中用过的废弃枪头、离心管等潜在被污染物品，要高压处理，以防实验室人为散毒。实验结束后对实验室内所有面、地面及墙面进行消毒，75%酒精空中喷雾，开启紫外等照射4小时以上。不用超过保质期的试剂盒，试剂盒保存合适的条件，忌多次反复冻融，储存时将存放试剂的冰箱与病原或核酸存放冰箱分开，定期除霜，保证低温。

　　非洲猪瘟病毒核酸检测方法多种多样，但目前来说，最适合猪大面积普及推广使用的方法为荧光PCR检测法。荧光PCR检测，没有最敏感只有更敏感，没有最准确，只有更准确，各种细节都影响检测结果。当前市场上非洲猪瘟荧光PCR检测试剂盒种类繁多，价格差别大，通过农业部比对的试剂盒质量未必适用于环境样本监测和异常猪只早期唾液检测，没有通过比对的厂家试剂盒质量未必不可以。一些厂家为占有市场打价格战，还有些厂家宣扬自己检测速度多么快。怎么选择对基层兽医人员来说确实很困难，要向经验丰富的同业人员请教，选择口碑好，性价比高的试剂，或者自己开展一些性能评价工作，对比筛选，选取适合自己的最佳试剂盒。笔者认为某些人提倡的猪场用多种的试剂盒检测的做法并不可取，可以选择最可靠的试剂盒多次检测。猪场实验室也可以根据OIE等权威单位公布的引物探针，自建检测方法，但一定要购买一些质量好的PCR试剂，充分做好比对验证，经过确认后方可使用。我们只有以精益求精之态度，持续改进涉及检测过程的各种环节，才能得到最可靠的结果。

　　PCR检测结果与临床相结合，核酸检测阳性只能表明样本中有非洲猪瘟核酸，并不能说明有活病毒存在，病毒死亡时，核酸仍然能检出，要结合临床情况，尽管这样一旦核酸检测阳性也应该警惕，密切注意猪群状态。对低拷贝样本反复检测时会出现时阴时阳的结果，如何判定结果常困扰检测人员。笔者认为根据核酸泊松分布原理，当核酸浓度低时可能会出现有时不能取到核酸，或取到的核酸不足以检测出，因此，在保证环境管控良好的情况下只要出现一次阳性，就判定为阳性。

　　实验室进行非洲猪瘟病毒核酸检测时要做好生物安全防控，严格遵守国家相关法律法规，防止一些潜在活性毒传出，污染环境，对一些检验剩下的样品及其他废弃物，进行高压灭菌处理，不要随意丢弃。定期使用紫外线、臭氧、核酸去除剂等对生物安全柜、超净台、离心机及实验室进行消毒，采用100g/L次氯酸钠或10ｍＬ/Ｌ过氧乙酸擦拭地面及工作台,合理通风避免实验室气溶胶污染，同时对定期实验室环境进行监控。